ELISA, EIA, WB, ICA, NAT – koji test za HIV odabrati?

Postaviti dijagnozu HIV-infekcije moguće je isključivo laboratorijski budući da simptomi nisu specifični. HIV-bolest može se manifestirati jako kasno nakon što se potpuno iscrpi imunosni sustav i nastupi stanje AIDS-a s pojavom oportunističkih infekcija. U vrijeme intenzivne informatizacije i razmjene podataka, AIDS ne bi smio biti prvi stadij u kojem se postavlja dijagnoza HIV-bolesti. Prihvaćanje vlastitog rizičnog ponašanja preduvjet je za samoinicijativno preventivno testiranje na HIV kao i na druge spolno prenosive bolesti. Prvi simptomi nekoliko tjedana nakon HIV-infekcije u akutnoj fazi bolesti mogu nalikovati različitim bolestima. Pojaviti se mogu povećani limfni čvorovi, temperatura, malaksalost, noćno znojenje, grlobolja, bolovi u mišićima, zimica, rjeđe osip, simptomi koji se viđaju i kod obične prehlade, mononukleoze ili limfadenopatija uzrokovanih različitim uzročnicima ili kao prodromi drugih bolesti. U to vrijeme, ako se zatraži liječnička pomoć, najvažnije je sagledati sve anamnestičke podatke i usmjeriti dijagnostiku. Imunost je u početku HIV-infekcije obično dovoljno snažna da se akutno stanje prevlada i prijeđe u prividno zdravlje tako da bolesnici često ne dođu liječniku. No, imunosni sustav se mora kontinuirano boriti i postepeno se iscrpljuje, sve dok ne dođe do kolapsa.

HIV danas ne bi smio biti zanemareni uzročnik na kojeg se zaboravi u diferencijalno-dijagnostičkom promišljanju. Detaljno uzeta anamneza koja obuhvaća i definiranje navika, životnog stila, pa tako i izlaganja rizičnom ponašanju, usmjerava potrebu testiranja HIV-a. S obzirom na specifičnost HIV-bolesti potrebno je dobiti suglasnost ispitanika za testiranje na HIV. Testiranje na HIV bolesniku je potrebno najaviti i objasniti zašto je nužno te kakav je daljnji postupak nakon saznavanja rezultata bilo pozitivnog ili negativnog. Suočavanje sa činjenicom o mogućoj doživotnoj bolesti, ispitanici mogu doživjeti i reagirati različito, pa je dostupnost stručne psihološke podrške posebno u vrijeme čekanja rezultata nužna.

Standardno testiranje za HIV najčešće započinje određivanjem specifičnih protutijela testom koji je poznat kao ELISA. ELISA je engleska kratica za enzyme-linked immunosorbent assay koja označava imunoenzimski test koji se provodi u udubljenjima na mikrotitarskoj ploči. Testovi nisu jednostavni za izvođenje i zahtijevaju laboratorijsku spretnost i iskustvo i mogu se raditi samo u dobro opremljenim laboratorijima. Suvremena tehnologija i ulaganja u razvoj novih metoda doveli su zadnjih godina do velikog napretka u brzini, jednostavnosti i točnosti testova. Sve češće manualni rad se zamjenjuje radom na različitim aparatima. Tehnike se temelje na imunoenzimskoj metodi, ali se ne radi nužno ELISA. Točnije je za testove kristiti pojam EIA (enzyme immunoassay). Signali odgovora pojačavaju se na različite načine čime su rezultati brže dostupni. Još do nedavno glavni nedostatak laboratorijskih testova za HIV bio je relativno dugo čekanje rezultata i kasno izdavanje nalaza. Zabilježeno je da čak trećina HIV-bolesnika koja je prošla savjetovanje prije testiranja, nakon uzimanja uzorka nikada nije došla po rezultate pretraga.

Veliki iskorak u dijagnostici bila je pojava brzih testova koji se mogu primjenjivati neposredno u blizini bolesnika i rezultati su dostupni vrlo brzo nakon uzimanja uzorka. Američka agencija FDA (Food and Drug Administration) odobrila je 2002.g. prvi brzi test za HIV za korištenje u bolnici, uz sigurnost rezultata koji je bio dostupan za 20 minuta od 99.6%. Ovi testovi poznati su kao „point-of-care“ (engl. mjesto skrbi) ili POC testovi budući da je rezultat dostupan dok je bolesnik još u tijeku zdravstvene obrade i skrbi koja mu se pruža i nakon priopćavanja rezultata. POC test se temelji ponovno na imunoenzimskoj metodi, a rezultat se očitava kao promjena boje na mjestu gdje se sastaju antigeni HIV-a koji se nalaze u testu s protutijelima na HIV iz uzorka ispitanika. Posebna tehnologija “OraSure” i testovi OraQuick proširuju mogućnost izvanbolničke primjene budući da se osim iz uzoraka krvi testovi mogu raditi i na uzorcima oralne tekućine. Pod pojmom oralna tekućina često se podrazumijeva slina što je samo djelomično točno. Radi se o uzorku koji se uzima obriskom gingive tj. područja uz zube. Slina predstavlja mješavinu žlijezda slinovnica i oralne tekućine i količina protutijela koja se nalazi u slini nije dovoljna za pouzdanu dijagnostiku ovim testom. Za točnost rezultata ključno je pravilno uzimanje uzorka.

Kod brzih testova u kojima se rezultat očitava prema pojavljivanju boje, pa se nazivaju imunokromatografski testovi (ICA), postoji niz zamki koje je potrebno poznavati da bi rezultat bio pouzdan. Svako testiranje za HIV metodama POC treba dobro organizirati i obavezno je provesti edukaciju osoblja koje će ga provoditi. Edukacija nije dovoljna samo prije započinjanja rada i stjecanja kompetencija već je potrebno kontinuirano provjeravati ispravnost stečenog znanja i njegovu primjenu. Kontrola kvalitete rada treba biti u nadležnosti lokalnog laboratorija koji bi trebao biti odgovoran za organizaciju mjesta testiranja i praćenje cjelokupnog rada te rješavanje mogućih nastalih problema pri interpretaciji rezultata. Prije odluke o uvođenju POC testova nužna je analiza financijske isplativosti budući da su POC testovi u osnovi skuplji od standardnih laboratorijskih testova. POC testovi imaju važno mjesto za testiranje teško dostupnih rizičnih populacija, kao i u uvjetima gdje zdravstvena skrb nije lako dostupna.

Kao jedna od mjera pokušaja smanjenja incidencije HIV-a je što ranije dijagnosticiranje HIV-infekcije što omogućava ranije započinjanje terapije. Američki centar za kontrolu bolesti CDC (the Centers for Disease Control and Prevention) preporuča HIV testiranja za sve američke građane u dobi od 13-64 godina. Da bi se to moglo provesti nužna je dobra dostupnost testova, ali i dostupnost potrebnih daljnjih postupaka i provođenja liječenja. Značenje rezultata brzog ICA testa jednako je kao laboratorijskog uz preduvjet da se testiranje radi u kontroliranim uvjetima pod nadzorom laboratorija. To znači da u slučaju pozitivnog nalaza bez obzira kojom metodom je rezultat dobiven pacijentu treba priopćiti nalaz i interpretirati ga u skladu s procjenom rizika evaluiranog tijekom predsavjetovanja. Osobi s visokim rizikom pozitivan nalaz treba priopćiti kao vjerojatno pozitivnu HIV-infekciju budući da je test visoko specifičan, uz napomenu da nalaz obavezno treba potvrditi u referentnom centru gdje će se napraviti dodatna testiranja. Osobi kod koje nije izgledno da ima HIV, primjerice HIV-negativne trudnice tijekom probira mogu imati lažno reaktivni rezultat, objasniti treba značenje nalaza te uputiti na neophodno dodatno potvrdno testiranje.

Poseban oprez treba biti s ispitanicima koji na testiranje dolaze ubrzo nakon rizičnog odnosa i dobiju primarno negativni nalaz. I tu je nužno detaljno savjetovanje i naručivanje na novo testiranje zbog tzv. perioda prozora u kojem su dijagnostički testovi za određivanje protutijela negativni, a bolesnik ima HIV. Zadnjih godina značajni iskorak u skraćenju perioda prozora je dostupnost ICA POC testa Alere Determine HIV 1/2 (Abbott) koji može istovremeno dijagnosticirati protutijela i antigen iz kapljice krvi iz prsta. Dokazivanje antigena skraćuje vrijeme prozora. U dijagnostici HIV-a kvaliteta testa ovisi o strukturi testa – vrsti reagensa, kvaliteti, aparatu. U laboratoriju češće će se za probir koristiti testovi za istovremeno dokazivanje antigena i protutijela (Ag/At) koji predstavljaju testove veće osjetljivosti nego testovi kojima se detektiraju samo protutijela. Kombinirani Ag/At testovi mogu ponekad dati više lažno pozitivnih rezultata. Interpretacija značenja rezultata svakako ovisi o prevalenciji u ispitivanoj populaciji i pozitivnim i negativnim prediktivnim vrijednostima. U populaciji s visokom prevalencijom HIV-a, vjerojatnost da je pozitivan nalaz zaista rezultat bolesti je visoka, za razliku od istog rezultata u populaciji niske prevalencije gdje je veća vjerojatnost da se radi o lažno pozitivnom rezultatu.

Suspektna dijagnoza HIV-a postavlja se prema rezultatima prvog testa uz pretpostavku da su rezultati pouzdani. Svatko tko se odluči raditi dijagnostiku treba se suočiti s mogućim laboratorijskim problemima koje treba znati riješiti. Pozitivne ili točnije reaktivne rezultate svakog primarnog testiranja mora se provjeriti dodatnim potvrdnim metodama. Standardni algoritam započinje prvim testom koji je ELISA, a potvrdni test je western blot (WB). U današnje vrijeme test WB sve se manje koristi premda je značenje pozitivnog nalaza još uvijek ključno. Razlog je složeni postupak, ali i predugo vrijeme potrebno da test, kao rezultat pojave specifičnih protutijela bude pozitivan. Kada je WB pozitivan dijagnoza je definitivna i potrebno je odrediti visinu viremije i status CD4+ limfocita T. U akutnoj recentnoj infekciji kada je rezultat EIA pozitivan u dvije različite metode testova za Ag/At, za potvrdu dijagnoze radi se NAT (nucelic acid test) za molekularno određivanja genoma, tj. nukleinskih kiselina HIV RNK. Razvijene su modifikacije WB u obliku imunoblot (IB) testova za razlikovanje infekcije HIV-1 od HIV-2 koje su ušle u algoritme testiranja. Najveći nedostatak WB/IB je što u akutnoj fazi HIV-infekcije može dati negativan rezultat budući da se određuju protutijela na specifične antigene koja se još nisu stvorila. WB se ne može smatrati potvrdnim za akutnu recentnu infekciju. U recentnoj fazi bolesti dijagnozu HIV-a procjenjuje se prema rezultatima dva imunoenzimna testa četvrte generacije kojima se istovremeno određuju antigeni i protutijela, a zatim se radi NAT. Nakon desetak dana testira se novi serum i radi potvrdno WB testiranje.

U svrhu povećanja dostupnosti i što ranijeg otkrivanja HIV-inficiranih osoba u nekim zemljama moguće je napraviti tzv. “kućni test”. Dva su koncepta mogućeg testiranja u kući. Jedna mogućnost tzv. Home Access je da se uzme uzorak krvi na odgovarajući način u posebnoj opremi koja se dostavlja ispitaniku nakon dogovora s laboratorijem i uzorak se poštom vrati u laboratorij gdje će se napraviti laboratorijsko testiranje. Druga je mogućnost da se u ljekarni ili drogeriji kupi OraQuick HIV set za testiranje.

Koncept “kućnog testiranja” Home Access, tj. samostalnog uzimanja uzorka krvi koji se poštom šalje u laboratorij za obradu, bio je odobren u Americi od FDA u srpnju 1996.g. Preduvjet za ovaj način testiranja je da osoba koja se želi testirati mora prvo nazvati besplatni broj i registrirati se pomoću anonimnog koda; provede se predsavjetovanje i kratki anonimni intervju o demografskim podacima. Osoba sakupi uzorak krvi na poseban filtr-papir koji dobije poštom i vrati uzorak u laboratorij za obradu. Za nalaz potrebno je ponovno nazvati besplatni broj i registrirati se preko svog anonimnog koda. Ako je rezultat pozitivan, potrebno je dogovoriti posjetu liječniku što prije.

Drugi način samostalnog testiranja pomoću testa OraQuick dostupan je u SAD-u od travnja 2013.g. Potrebno je proučiti postupak i uzeti uzorak oralne tekućine odnosno sline, staviti uređaj u otopinu za testiranje i očitati rezultat nakon 20-40 minuta kod kuće. Negativni rezultat je visoko siguran, ako se ne radi o prvim danima recentne infekcije. Pozitivni rezultati nisu konačni i korisnici se upućuju na praćenje u zdravstvenu ustanovu. Proizvođač se obvezuje pružati 24-satnu besplatnu uslugu savjetovanja i pomaže osobama s pozitivnim rezultatima da dobiju što brži pristup lokalnim klinikama.

Glavna razlika između ovih dvaju načina kućnog testiranja na HIV je da se sustav Home Access temelji na rezultatima krvnih testova koje analiziraju profesionalci u laboratoriju, a OraQuick test temelji se na kemijskim reakcijama koje ispitanik mora sam procijeniti prema promjeni boje koja ponekad može biti nježna i jedva vidljiva. Oba su ispitivanja vrlo učinkovita pri otkrivanju negativnih rezultata sa stopom preciznosti od 99.9%.

Kada je riječ o pozitivnim rezultatima, testovi iz krvi imaju stopu točnosti od 99.7%, a nešto manju 91.7% kada se testiranje radi iz oralne tekućine. To znači da gotovo 1 od 10 osoba koje koriste OraQuick HIV test kit može imati lažno negativan rezultat. Podaci naglašavaju potrebu savjetovanja i dobrog poznavanja prednosti i nedostataka pojedinih metoda. Brzi testovi, ali samo iz krvi, koji mogu istovremeno otkriti antigene HIV-a kao i protutijela (Ag/At) Alere Determine HIV 1/2 (Abbott) znatno smanjuju mogućnost lažno negativnih rezultata zbog skraćivanja perioda prozora. Populacija koja zahtijeva posebni oprez pri testiranju i odabiru brzih testova je novorođenčad kod kojih rezultati mogu biti varijabilni. Rezultati mogu biti lažno pozitivni zbog pasivnog prijelaza majčinih protutijela, ali i lažno negativni. U novorođenčadi se bilježi niska osjetljivost, ali i niska pozitivna prediktivna vrijednost brzih testova. Svjetska zdravstvena organizacija preporuča da se za djecu starosti 4 do 18 mjeseci za određivanje HIV-infekcije ne koriste serološki testovi. Za rizičnu populaciju mlađu od 18 mjeseci HIV-infekcija se treba definirati prema statusu majke uz obavezno NAT testiranje i daljnje serološko praćenje.

Zaključno, laboratorijska dijagnostika infektivnih bolesti pa tako i HIV-a nije jednostavna. Poznavanje kliničke slike i patogeneze kao i epidemioloških podataka omogućava odabir optimalnih testova za postavljanje dijagnoze. Nove tehnologije doprinose usavršavanju dijagnostike sa ciljem što ranije dostupnosti pouzdanih rezultata. No, svaki test ima svoje prednosti i ograničenja. Potrebno je dobro poznavati test i uvjete u kojima se koristi kako bi se prednosti iskoristile, a nedostaci izbjegli. Odabir testa ovisi o sredini i uvjetima u kojima se dijagnostika provodi kao i o populaciju koja se testira. Definirati treba i financijske mogućnosti koje prate svaki laboratorijski rad kako bi se mogli zadovoljiti kriteriji kvalitete i dobili pouzdani rezultati. Jednostavnost metoda i testiranje izvan laboratorija nosi rizik ako se ne provodi u skladu s dobrom laboratorijskom praksom uz pomoć lokalnog kliničkog laboratorija i liječničkog sagledavanja značajnosti nalaza.

Uz svu dostupnu tehnologiju neophodno je respektirati potrebu pouzdane stručne interpretacije rezultata u skladu sa svim parametrima povezanima uz bolesnika kao i složeni postupak priopćavanja nalaza.

Autor: doc. dr. sc. prim. Oktavija Đaković Rode, dr. med.

Izvor: HIVhep Godišnjak za zdravstvene djelatnike, Izdanje 2019.


U partnerstvu sa: