Početak osamdesetih godina prošlog stoljeća obilježila je pojava nepoznate bolesti koja se širila u razvijenim zemljama i odnosila živote prethodno zdravih mladih ljudi. Američki centar za kontrolu bolesti (CDC) u časopisu MMWR (Morbidity and Mortality Weekly Report) upozorava na pojavu teških pneumonija uzrokovanih oportunističkim patogenom Pneumocystis carinii (PCP) u pet prethodno zdravih mlađih muškaraca koji su imali spolne odnose s muškarcima (MSM). Prije objavljivanja članka, dva su bolesnika umrla, a ostali su preminuli ubrzo zatim. Osim slučajeva PCP, onkolozi su zamijetili porast Kaposijevih sarkoma u populaciji MSM. Broj bolesnika s neočekivanim oportunističkim infekcijama je rastao. Osim u populaciji MSM, PCP se češće dijagnosticirao u osoba s hemofilijom.
Do kraja 1981. teški oblici imunodeficijencije s opisanim kliničkim slikama zabilježeni su u 337 osoba od kojih je čak 130 umrlo. Postavljena je nova dijagnoza AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) nepoznatog uzroka s letalnim ishodom. CDC 1982. g. definira AIDS kao bolest koja se može predvidjeti prema oštećenju stanične imunosti, a pojavljuje se u osoba bez prethodno poznatog uzroka za smanjenje imunosti. Specifični test kojim bi se dokazao AIDS nije postojao, no ne postoji ni danas, jer AIDS je klinička dijagnoza koja uključuje više parametara. Iako se nije znalo što uzrokuje AIDS, prema kliničkim i epidemiološkim zapažanjima postavljena je hipoteza da se vjerojatno radi o agensu koji se prenosi intimnim izravnim kontaktom putem sluznica posebno među MSM, parenteralno kao kod intravenskih korisnika droga i vjerojatno preko transfuzijskih pripravaka faktora VIII u oboljelih od hemofilije. Bolest se nazivala „Four-H club“ – znalo se da se najčešće javlja u osoba s hemofilijom, muških homoseksualaca, heroinskih ovisnika i Haićana (AIDS je bio registiran u velikom broju na Haitiju). Tek kasnije utvrđen je spolni put prijenosa i na žene. Kapljični prijenos i uobičajeni kontakti nisu se smatrali vjerojatnim načinima širenja.
Zaključeno je da su putovi prijenosa slični kao kod hepatitisa B. Uvedene su preporuke za primjenu posebnih mjera zaštite za kliničke i laboratorijske djelatnike iako nije bilo dokaza za prijenos AIDS-a kontaktom na zdravstveno osoblje. Nova bolest pojavljivala se bez poznatog razloga, mogućnosti dijagnostike i liječenja. Bilo je očito da će trebati uložiti velike napore, ali i financijska sredstva za pronalaženje etiologije AIDS-a. Pod pritiskom bolesnika i javnosti da se pokuša pronaći rješenje, tek 1983. g. američki je kongres odobrio sredstva za istraživanja. Sve veći broj oboljelih bez nade poticao je sve više akcija – od objavljivanja osobnih svjedočanstava oboljelih, praćenja podataka o širenju, organiziranja posebnih bolničkih odjela za oboljele s AIDS-om; informiranja zdravstvenih djelatnika, npr. NIAID (National Institute of Allergy and Infectious Diseases) pokreće znanstveno stručni časopis kako bi se ubrzao i olakšao protok informacija. Bilo je to vrijeme prije interneta u kojem je AIDS predstavljao konačnu dijagnozu.
Dok su se u Americi tek odobravala sredstva za istraživanja AIDS-a, Françoise Barré-Sinoussi i Luc Montaigner u pariškom Institut Pasteur otkrili su novi retrovirus koji je napao limfocite u pacijenta s povećanim limfnim čvorovima. Bilo je to ključno otkriće koje je dalo nadu oboljelima i otvorilo vrata za pronalaženje dijagnostike i terapije. Virus je nazvan LAV (Lymphadenopathy Associated Virus). Nobelova nagrada za otkriće virusa LAV kojeg danas poznajemo kao HIV, uslijedila je tek 2008.g. nakon rasvjetljavanja sage između pariških znanstvenika i američkog tima koji je vodio dr. Robert Gallo. Naime, dr. Gallo je 1984. objavio otkriće virusa HTLV-IIIB (Human T-Cell Leukaemia/Lymphoma Virus Type IIIB) koji uzrokuje AIDS i prisvojio zasluge za pronalazak. Godinama kasnije utvrđeno je da se radilo o istom virusu koji su prvi pronašli Barré-Sinoussi i Montaigner, a koji je na nepoznati način dospio u Gallov laboratorij.
Istovremeno s objavljivanjem Gallovog otkrića, objavljeno je da su razvijeni prvi dijagnostički testovi za identifikaciju HTLV-III iz krvi te da se u sljedeće dvije godine može očekivati cjepivo. Od tada je prošlo 35 godina i cjepiva još nema, a dijagnostički testovi se kontinuirano tehnološki unapređuju. Prvi komercijalno dostupan test za testiranje krvnih pripravaka pojavio se 1985. godine i nije bio namijenjen za testiranja bolesnika s AIDS-om i suspektnom HIV-infekcijom. U Hrvatskoj, odnosno tadašnjoj Jugoslaviji, aktivno se prate i primjenjuju sva znanja i spoznaje o novom virusu i dijagnostičkim postupcima. Započinje se testiranje krvi i krvnih pripravaka i organizira dijagnostika HIV-a u Klinici za infektivne bolesti u Zagrebu. Primjenjuju se i prilagođavaju suvremeni algoritmi testiranja prema svjetskim smjernicama. Kontinuirano se provodi edukacija zdravstvenih i laboratorijskih radnika kao i edukacija opće populacije o načinima prijenosa i mjerama sprječavanja širenja.
PRVA GENERACIJA TESTOVA ZA HIV
Ubrzo nakon otkrića virusa koji se povezao sa slučajevima AIDS-a i koji je 1983. u Francuskoj nazvan LAV, a 1984. u Americi HTLV-III, razvijeni su prvi testovi za testiranje krvnih pripravaka, ali ne i za dijagnostičku upotrebu. Budući da nije postojao način kako utvrditi etologiju AIDS-a, testovi su se na inzistiranje kliničara počeli primjenjivati i za dijagnosticiranje bolesti. Određivala su se specifična antivirusna protutijela u krvi bolesnika pomoću imunoenzimskog testa ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ili kemiluminscentne metode. U testovima su se nalazili antigeni dobiveni iz liziranih virusnih staničnih kultura. Iz krvi odnosno seruma dijagnosticirala su se protutijela IgG na HIV-1. Osjetljivost testova koji su primarno bili namijenjeni za testiranje krvi i krvnih pripravaka bila je općenito visoka, ali je vrijeme negativnog prozora nakon infekcije, u kojem protutijela nisu bila detektabilna iznosilo 12 tjedana pa i više.
Visoka osjetljivost testova izrazito važna za sigurnost krvnih pripravaka, rezultirala je velikim brojem lažno pozitivnih rezultata u bolesnika, posebno u populacijama niskog rizika za HIV. Razlozi za lažno pozitivne rezultate mogu biti različiti, npr. autoimune bolesti, druge infekcije, trudnoća, dijaliza ili nespecifične reakcije. Pozitivna prediktivna vrijednost probirnih testova prve generacije u populacijama niskog rizika bila je manja od 50%. Uvedeno je stoga obavezno potvrdno testiranje svih primarno pozitivnih odnosno reaktivnih uzoraka metodom Western blota (WB) ili imunofluorescentnim testom (IFA). Testovi WB i IFA detektirali su također samo protutijela IgG anti-HIV i imali su negativni prozor oko 6 tjedana, ali su bili visoko specifični. Prema tadašnjim preporukama za testiranje, serum se nakon prvog pozitivnog nalaza ponovno testirao u duplikatu. Ako su jedan ili oba nalaza opetovano bili reaktivni, obavezno je trebalo napraviti potvrdno testiranje WB ili IFA. Nakon pozitivnog potvrdnog testiranja postavljena je dijagnoza HIV-bolesti.
DRUGA GENERACIJA TESTOVA ZA HIV
Problemi s lažnim rezultatima potaknuli su daljnji razvoj ELISA testova i pojavu novih generacija testova. Drugu generaciju testova karakterizira dodavanje rekombinantnih antigena, posebno specifičnog p24 HIV1, u bazu testa ELISA. Saznanja o različitim vrstama i tipovima HIV-a, npr. značenje HIV-2 u Zapadnoj Africi, nametnula su potrebu uključivanja dodatnih antigena HIV-2 i HIV-1grupe O. Negativni prozor skraćen je na 4 do 6 tjedana. Potrebno potvrdno testiranje WB ili IFA osim za dokazivanje infekcije HIV-1, podrazumijevalo je i razlikovanje infekcije HIV-2. Testovi WB za HIV1 i HIV-2 u početku su se radili odvojeno. Specifična protutijela detektirala su se na proteine koji su bili razdvojeni elektroforezom i očitavanje rezultata nije bilo jednostavno. Proizvodnja rekombinantnih i sintetiziranih antigena omogućila je integriranje specifičnih proteina oba virusa na jednu traku. Nakon nalaza protutijela u zajedničkom probirnom testu, definiranje vrste infekcije HIV-1 ili HV-2 moglo se odraditi u jednom testiranju dokazom specifičnih protutijela na specifične antigene npr. gp41 i gp120 za HIV-1 te gp36 i gp105 za HIV-2. Prvi CDC algoritam za testiranje HIV-a koji je uključio potvrdnom testiranje i definiranje tipa infekcije objavljen je 1989.g. Osnovna probirna metoda u testovima prve i druge generacije bila je indirektna ELISA za određivanje protutijela anti-HIV IgG.
TREĆA GENERACIJA TESTOVA ZA HIV
Poznato je da se protutijela IgM pojavljuju ranije od IgG, pa su ubrzo rezvijeni testovi kojima su se osim IgG određivala protutijela IgM. Testiranje protutijela IgM uz raniji IgG skratilo je negativni prozor na oko 3 tjedna. S obzirom na tijek bolesti, odvojeno testiranje IgM i IgG nije bilo klinički opravdano, pa se određuju ukupna protutijela. Za razliku od indirektne metode ELISA, u kojoj se serumska protutijela vežu na antigen u testu i stvoreni kompleks se vizualizira pomoću sekundarnog enzimom obilježenog protutijela (“antitijelo-konjugat”), razvijena je tzv. sendvič metoda ELISA, u kojoj se kompleks antigena i serumskih protutijela prepoznavao pomoću sintetiziranih sekundarnih fluorescentnom bojom ili enzimom obilježenih HIV-antigena (“antigen-konjugat”). Specifičnost testova za HIV-infekciju bila je bolja. Tehnološki razvoj laboratorijske dijagnostike koji započinje 90-ih godina, zajedno s razvojem lijekova i istraživanjima cjepiva jedan je od najvećih industrijskih portfelja u razvijenim zemljama. Nove tehnologije slijede suvremena saznanja o HIV-u, olakšavaju i ubrzavaju postavljanje dijagnoze i stalno se usavršavaju. Visoki morbiditet i mortalitet mladih ljudi u razvijenim zemljama bio je dovoljan poticaj za ulaganja u razvoj dijagnostičkih testova.
Raširenost HIV-a je globalna i djelovati se mora sveobuhvatno kako u razvijenim tako i u siromašnim i slabije razvijenim područjima u kojima je značajno veći broj bolesnika. Bilo je potrebno pronaći testove koji neće zahtijevati skupu opremu i koji će biti jeftini i jednostavni za upotrebu te lako dostupni. Testovi koji su se mogli koristiti u različitim sredinama nazvani su point-of-care (POC) i u prvo su vrijeme bili poznati kao testovi koji se rade uz krevet krevet bolesnika. Cilj ovih testova je dobiti rezultat jako brzo dok je ispitanik još u tijeku obrade na mjestu testiranja. Takav pristup omogućio je neposredno uključivanje HIV-pozitivne osobe u skrb i smanjio broj osoba koje su se testirale, a nikada nisu došle po svoje rezultate. POC testovi su jednostavni i temelje se na vezivanju antigena i protutijela , a stvoreni kompleks mora se učiniti vidljivim. Prvi POC testovi bili su aglutinacijske metode, a vrlo brzo razvijeni su testovi u kojima se reakcije odvijaju na nitroceluloznoj traki (ICA).
Dvije su osnovne metode ICA u kojima se rezultat očitava prema promjeni boje na nitroceluloznoj podlozi: metoda imunokromatografije (lateral flow) u kojoj serum putuje kapilarno kroz nitroceluloznu traku i aktivira potrebne dehidrirane reagense, i metoda imunokoncentracije (flow-through) u kojoj se uzorak nanosi na podlogu i na njega se dodaje konjugat proteina A i koloidnog zlata, reagens koji vizualizira stvoreni kompleks antigena i protutijela. Imunokoncentracija (flow-through) obično daje brži rezultat od imunokromatografskog testa (lateral flow). POC/ICA testovi ne zahtijevaju posebnu opremu pa se mogu izvoditi i izvan laboratorija u zajednici što im je prednost u odnosu na ELISA. Prilagođeni su za izvođenje iz različitih uzoraka. Mogu se raditi iz pune krvi dobivene punkcijom iz vrha prsta, oralne tekućine, ali i iz klasičnih uzoraka seruma i plazme dobivenih vađenjem krvi iz vene. Važno je naglasiti da se osjetljivost jednog POC testa razlikuje ovisno o vrsti uzorka – najveća je ako se izvodi iz seruma i plazme, a nešto manja je iz kapilarne krvi ili oralne tekućine.
POC testovi treće generacije važan su dio rutinske dijagnostike sa svim prednostima i nedostacima koje mora poznavati svatko tko se odluči za njihovo izvođenje. Potreba za što ranijim otkrivanjem infekcije dovela je do razvoja testa ELISA za određivanje antigena p24. Dijagnostika za HIV antigen p24 dodatno je skratila je negativni prozor i omogućila je detekciju HIV-a unutar 2 tjedna nakon zaražavanja. Algoritam potvrdnog testiranja nije se promijenio i WB je obavezan prije postavljanja HIV-dijagnoze kao i nakon testova druge generacije. Negativan ili neodređeni rezultat za HIV-1 indikacija je za određivanje infekcije HIV-2. Nakon otkrića molekularne metode PCR (polimerazna lančana reakcija) krajem osamdesetih, tvrtka Roche razvila je 1991.g. inačicu RT-PCR koja je omogućila detekciju genoma HIV-a što je bio važan iskorak u dijagnostici HIV-a. Osim seroloških, razvijeni su aparaturni virusološki testovi. Određivanje HIV-a u krvi značajno je skratilo vrijeme negativnog prozora. U molekularnoj dijagnostici se za vrijeme od trenutka zaražavanja do pozitivne viremije, odnosno detekcije virusa u krvi koristi pojam ‘eklipsa’ i iznosi desetak dana. S druge strane pod pojmom perioda prozora tradicionalno se smatra vrijeme od početka infekcije do serokonverzije odnosno pojave detektabilnih protutijela i potvrde HIV infekcije.
ČETVRTA GENERACIJA TESTOVA ZA HIV
Tijekom 1990-ih godina, AIDS je bio vodeći uzrok smrti među muškarcima u dobi od 25 do 44 godina. Stalno povećanje broja oboljelih, kasno prepoznavanje bolesti zbog dugog vremena latencije HIV-a koji progredira u AIDS, neprepoznavanje rane faze bolesti bili su stalni poticaj za razvoj i usavršavanje tehnologija posebno usmjerenih na što ranije otkrivanje HIV-infekcije. Pronalazak i uvođenje visoko aktivne anitretrovirusne terapije (HAART) 1995. dovelo je do značajnog pada mortaliteta i unapređenja kvalitete života. Postalo je jasno da se jedino ranim otkrivanjem infekcije može utjecati na epidemiologiju HIV-a i pokušati smanjiti širenje bolesti. No, da bi se osobe uspješno liječile potrebno je postaviti dijagnozu i to što ranije na početku bolesti. Novi testovi dodatno su skratili negativni prozor na oko 2 tjedna.
Razvijeni su tzv. kombinirani testovi ELISA i CLIA (kemiluminiscentni test) kojima se antigeni i protutijela određuju istovremeno. Kombinirani test daje pozitivan rezultat nakon reakcije s prisutnim antigenima i/ili protutijelima pri čemu nije moguće razlikovati koja je komponenta pozitivna. Test se odmah počeo koristiti u Europi, a u Americi ga je FDA odobrila tek 2010.godine. Rano otkrivanje HIV-infekcije i skraćivanje negativnog prozora što omogućuju suvremeni testovi, poljuljalo je tadašnje važeće algoritme za interpretaciju rezultata. Naime, test WB je pozitivan kasnije nego ELISA/CLIA što je stvaralo nedoumice pri diskordantnim rezultatima zbog lažno negativnog potvrdnog testa u bolesnika u ranoj fazi HIV-infekcije. Trebalo je stoga upozoriti liječnike na značenje HIV-dijagnostike i mogućnosti testova. Ukazivalo se na važnost osjetljivosti i specifičnosti pojedinih metoda te na značenje pozitivnih i negativnih prediktivnih vrijednosti koji ovise o prevalenciji bolesti i karakteristikama ispitivane populacije. Ako se jedan test provodi u populaciji niskog rizika i dobije se pozitivni rezultat, velika je vjerojatnost da će se raditi o lažno pozitivnom rezultatu koji je uvijek potrebno provjeriti i potvrditi. S druge strane u populaciji visokog rizika pozitivan rezultat istog testa ima značajno veću pozitivnu prediktivnu vrijednost i s većom vjerojatnosti će zaista značiti prisutnu bolest. Novi algoritam CDC-a 2011-2013.g. predvidio je početno testiranje kombiniranim testom, a u slučaju pozitivnog rezultata napraviti diferencijacijski test i definirati radi li se o infekciji HIV-1 ili HIV-2. Ako je diferencijacijski test negativan ili nedefiniran, a uzorak je opetovano pozitivan drugim testom četvrte generacije uvodi se molekularno određivanje HIV-a. Radi se NAT (nucelic acid test) odnosno kvalitativni PCR test za određivanje HIV-1 RNK i detektira prisutnost virusa. Izbačen je klasični WB test.
Kao diferencijacijski test CDC je preporučio visoko specifičan, brzi i jednostavni test Multispot Bio-Rad, test treće generacije koji nije registriran u Europi. Od 2016.g. Multispot je povučen i zamijenjen je drugim brzim poluautomatiziranim testom Genius HIV 1/2 koji se koristi isključivo kao dodatni diferencijacijski test nakon testiranja kombiniranim testom Ag/At. Testovi četvrte generacije povezani su uz automatizirane aparate što predstavlja problem u slabije razvijenim siromašnim zemljama u kojima je prevalencija HIV-a najčešće visoka. Kao suprotnost velikim strojevima, 2013. g. pojavio se POC test za istovremeno određivanje p24 antigena i protutijela na HIV-1 i HIV-2 (Alere Determine Ag-Ab Combo). Test Alere Determine Ag-Ab Combo namijenjen je prvenstveno za područja u kojima nije dostupna aparaturna oprema i testiranje se radi u laboratoriju. Test pokazuje odličnu osjetljivost i specifičnost za protutijela, ali je osjetljivost za antigen nešto slabija (oko 88%). Osjetljivost se značajno povećava ako se testira plazma umjesto pune krvi. Tako i jednostavni POC testovi prate potrebu ranog otkrivanja infekcije. Rade se samo iz krvi, a diferenciraju i prikazuju odvojene rezultate za antigen i anti-HIV protutijela. Svrstavaju se u testove generacije 4.5 jer ne mogu razlikovati radi li se o protutijelima na HIV-1 ili HIV-2. Preporučaju se za laboratorijsko testiranje u uvjetima gdje nisu dostupni aparati.
PETA GENERACIJA TESTOVA ZA HIV
Automatizirani strojevi i napredna tehnologija u serološkoj dijagnostici omogućili su da se rezultati kombiniranih testova mogu iskazivati kao pojedinačni nalazi za antigen i specifična protutijela na HIV-1 i HIV2. U jednom testiranju dobiju se tri rezultata – jedan za antigen i dva za protutijela anti-HIV1 i anti-HIV2. Diferencijacija specifičnih protutijela je odmah dostupna. Postaje upitna potreba za dodatne diferencijacijske testove i nameće se potreba usklađivanja algoritama s novim metodama.
ZNAČENJE VRSTA UZORAKA
Evaluacije metoda za dijagnostiku HIV-a pokazale su da se karakteristike testova razlikuju ne samo po tehnologiji i korištenim vrstama antigena, već da ovise i o uzorcima koji se testiraju. Ista metoda može imati različitu osjetljivost i specifičnost ovisno o vrsti i kvaliteti ispitivanog uzorka. Protutijela se mogu određivati u serumu, plazmi, punoj krvi (npr. kapljica iz vrha prsta) i oralnoj tekućini. Najviša osjetljivost i specifičnost je u laboratorijskim testovima iz seruma ili plazme. Posebna pozornost potrebna je u interpretaciji rezultata testa POC OraQuick kada se radi iz oralne tekućine. OraQuick ima mogućnost detekcije vrlo malih količina protutijela i velika mu je prednost jednostavnost uzimanja uzorka kao i načina testiranja. Oralna tekućina uzima se brisanjem isključivo područja uz gingivu. Ne smije se testirati slina brisanjem jezika ili usne šupljine. Osjetljivost OraQuicka nešto je niža iz oralne tekućine nego ako se isti test izvodi iz seruma ili plazme. Negativni prozor iz oralne tekućine je dulji i mogućnost za lažno negativni rezultat u ranoj fazi infekcije je veća. Koncentracija protutijela u oralnoj tekućini oko 300 puta je manja nego u plazmi. Ovaj test nije idealan u recentno akviriranoj HIV-infekciji.
DIJAGNOSTIČKI ALGORITMI
Istovremeno s razvojem testova prilagođavali su se postupnici ili algoritmi. Svima je zajedničko da se prije postavljanja dijagnoze HIV-infekcije primarno pozitivni test obavezno treba potvrditi osjetljivim i visoko specifičnim testom kako bi se isključili lažno pozitivni rezultati. Koristiti se može kombiniranje dva POC testa ili dva laboratorijska testa kao i kombiniranje POC i laboratorijskog testa. Predloženo je tzv. serijsko testiranje u kojem se testiranje drugim testom radi ako je prvi test dao pozitivan rezultat, što je u skladu s tzv. tradicionalnim načinom testiranja. Drugi je prijedlog bilo tzv. paralelno testiranje, u kojem se simultano provodi testiranje s dva različita najčešće POC testa, a za definiranje dijagnoze u slučaju diskordantnih rezultata potrebno je napraviti treće testiranje.
Budući da su se POC testovi najčešće koristili u slabije razvijenim područjima s visokom prevelencijom HIV-a, prijedlog Svjetske zdravstvene organizacije (WHO) još 2004.g. bio je da se općenito koristi serijsko testiranje testovima čija je osjetljivost i specifičnost ≥ 99%. Suvremeni algoritmi uključuju i molekularne testove u slučajevima diskordantnih rezultata imunotestova za potvrdu odnosno za definiranje visine viremije i procjene statusa infekcije. Molekularni testovi postaju sve dostupniji, ali za sada nije prihvaćeno da se koriste kao probirni testovi.
DIJAGNOSTIČKI IZAZOVI
Akutna HIV-inekcija (AHI) najveći je dijagnostički izazov i nije ju moguće dijagnosticirati testovima samo za protutijela. Određivanje antigena i HIV-1 RNK ključno je za otkrivanje AHI. Početno testiranje na HIV započinje serološkim testom. Simptomi HIV-infekcije obično se pojavljuju unutar 2 tjedna od zaražavanja i tada je obično detektabilan antigen p24 koji se nalazi u testovima četvrte generacije. Antigen p24 postepeno raste tijekom 2.5 do 3 tjedna nakon infekcije; koncentracija HIV RNK u plazmi također postepeno raste tijekom prvih tjedan i pol do 2 i doseže najvišu razinu oko 3 do 6 tjedana nakon infekcije. Nakon 3 do 4 tjedna protutijela su detektabilna testovima treće generacije, dok su drugom generacijom testova bila detektabilna najranije nakon 4.5 do 6 tjedana. Test WB obično je pozitivan nakon oko 5-6 tjedana. Neodređeni rezultat WB obično je povezan uz protutijela anti-p24 što je i najčešći razlog lažno pozitivnih EIA rezultata. POC testovi obično ne sadrže p24, pa je broj lažno pozitivnih rezultata u POC testovima manji nego u EIA.
Za osobe s visokim neposrednim rizikom za recentnu HIV-infekciju, osim standardnog serološkog testiranja na samom početku pojave simptoma potrebno je evaluirati potrebu za određivanje HIV-1 RNK, odnosno ponoviti testiranje nakon nekoliko dana kako bi se što ranije postavila dijagnoza i započela terapija. Važno je stoga provesti savjetovanje prije testiranja, kao i nakon testiranja pri priopćavanju bilo negativnog ili pozitivnog rezultata. Socijalni aspekt i stigma koja prati HIV odražavaju se i na dijagnostiku. Poseban izazov u dijagnostici i interpretaciji rezultata predstavlja rano uvođenje terapije, preekspozicijska i postekspozicijska profilaksa te infekcije u djece mlađe od dvije godine. Primjena preekspozicijske profilakse (PrEP) odgađa stvaranje protutijela u zaraženih osoba. Odgođeni serološki odgovor zabilježen je i više od 100 dana nakon infekcije, posebno kada se HIV određivao POC testom. Stoga osobe koje uzimaju PrEP testiranje trebaju raditi laboratorijskim testovima iz seruma ili plazme. Isto vrijedi i za osobe koje su na postekspozicijskoj terapiji – za njih je obavezno testiranje iz seruma ili plazme laboratorijskim kombiniranim Ag/At testom uz dodatno testiranje nakon 4-6 tjedana i zatim nakon 3 mjeseca. Ako je ekspozicija bila istovremeno s hepatitisom C testiranje treba ponoviti i nakon 6 mjeseci.
Veliku ulogu u ranom otkrivanju HIV-infekcije imaju testiranja u zajednici. Programi i centri za testiranje u zajednici trebaju biti dobro organizirani, pod pokroviteljstvom referentnog centra odnosno lokalnog laboratorija koji će osigurati podršku u testiranju i provoditi kontrolu svih postupaka – od odabira testova, organizacije prostora, edukacije osoblja do uzimanja uzoraka, odlaganja otpada i provođenja kontrole svih postupaka. Izuzetno je važan pozitivan stav osoblja koje radi testiranje jer se najčešće radi o osoblju koje nema laboratorijsko predznanje. Ispitivači moraju biti educirani za izvođenje testova i moraju znati odgovoriti na različite situacije u kojima rezultati mogu biti neuobičajeni. U takvim slučajevima važna je podrška suradnog laboratorija. Jedino zajedničkim radom referentnog laboratorija i centra za testiranje osigurat će se dobra praksa koja će rezultirati sigurnim i pouzdanim rezultatima koje treba priopćiti ispitaniku, a o kojima ovisi daljnji tijek postupanja. Tradicionalni pristup testiranju na HIV iniciran je od davatelja usluga i WHO takvu strategiju naziva pristupom ‘5Cs’: Consent, Confidentiality, Counseling, Correct results, Connection (pristanak, povjerljivost, savjetovanje, ispravni rezultati, povezivanje).
Zadnjih godina inicijativa za testiranje sve više se usmjerava na pojedinca i njegovu aktivnu ulogu u kontroli vlastitog života što su potaknule i inovativne dijagnostičke tehnologije kao i veliki utjecaj interneta. Sve su to iskoraci i dijagnostički izazovi. Unatoč velikom broju testiranja koje se provodi, procjenjuje se da oko 30-40% osoba s HIV-om ne zna 28 29 HIVhep godišnjak za zdravstvene djelatnike svoj HIV-status. HIV samotestiranje (HST) još je jedan od pokušaja ranog otkrivanja HIV-infekcije. Testiranje se provodi jednostavnim neinvazivnim metodama u privatnosti doma, no otvaraju se etičke, legalne i socijalne dileme. WHO preporuča HST od 2016.g. Do srpnja 2018.g. više od 40 zemalja odobrilo je samotestiranje u različitim oblicima kao i prodaju testova putem interneta ili ljekarni. Provedba kontrole nad proizvodima koji se distribuiraju predstavlja veliki izazov. Potrebno je strogo pridržavanje legislative oko distribucije medicinskih proizvoda da se osigura njihova kvaliteta. Nadalje, kako bi se samotestiranje provodilo bez štetnih posljedica, centri za testiranje u zajednici, kao i zdravstvene ustanove trebali bi pružati korisnicima stalnu podršku oko testiranja.
U Europi općenita je preporuka da HIV-testiranje treba biti dobrovoljno, povjerljivo i uz pristanak (u nekim zemljama obavezan je potpisani pristanak). HST je odobren u 8 europskih zemalja. Samo u 6 država HST se smije raditi iz kapljice krvi. Nemedicinsko osoblje u 14 zemalja ima dozvolu za izvođenje testova u zajednici. Testiranje na HIV u Hrvatskoj je dobrovoljno i provodi se u medicinskim ustanovama i savjetovalištima nakon dobivene suglasnosti, pri čemu se preferira potpisani pristanak.
U Hrvatskoj testiranje smije provoditi educirano medicinsko osoblje. CDC od 2006.g. preporuča da testiranje na HIV postane dio rutinske prakse te predlaže da se testiraju sve odrasle osobe na prisutnost protutijela. Dozvoljeno je da se testiranje provodi slobodnije i da nalazi više ne moraju biti tajni budući da se ranije nisu smjeli unositi u informatički sustav. Početak primjene ovih promijenjenih preporuka u SAD-u moguć je tek nakon prihvaćanja posebnih amandmana tako da se testiranje na HIV razlikuje u različitim državama. Samotestiranje potiče aktivnu ulogu samog korisnika u otkrivanju HIV-a. Prije uvođenja ovog oblika testiranja potrebno je sagledati prednosti i nedostatke. Prilagodba sredini je ključna. Neka ograničenja HST predstavljaju: izostanak savjetovanja prije i nakon testiranja; upitno može biti pravilno izvođenje i interpretacija testa, potreba potvrdnog testiranje, povezivanje sa zdravstvenom skrbi i liječenje u slučaju reaktivnog tj. pozitivnog nalaza, značenje perioda negativnog prozora koji može biti produljen kod HST ili tijekom PrEP.
Odluka o samotestiranju mora biti vlastita i nikoga se ne smije nagovarati. Testovi nisu namijenjeni za testiranje djece mlađe od 2 godine. Za testiranje adolescenata preporučena dobna granica je oko 15 ili 16 godina. Postoji bojazan od štetnog utjecaja na psihičko stanje pri samostalnom očitavanju pozitivnog rezultata. Međutim WHO navodi da nakon milijuna testiranja nisu zabilježeni slučajevi suicida kao ni nasilja nad intimnim partnerima. Korisnici su naglasili pozitivan stav prema samotestiranju koje im je omogućilo rani početak liječenja kao i osvješćivanje o statusu i primjeni preventivnih mjera. Nije zabilježen porast rizičnog ponašanja nakon negativnog rezultata.
Alternativa samotestiranju je samostalno uzimanje uzoraka (self-sampling), npr. oralne tekućine ili kapljice krvi iz prsta, na propisani način u privatnosti, i slanje u laboratorij na tradicionalno testiranje. Rezultati se preuzimaju kasnije putem individualnog savjetovanja u ustanovi, telefonski, SMS-porukom, emailom ili preko sigurnih web-stranica. Iako se ovakav način testiranja čini prihvatljiv i ima prednosti nad HST, nije još široko u upotrebi. Današnja moderna tehnologija najviše je usmjerena na POC molekularne testove za određivanje virusa, koji imaju najkraći period prozora. Sve češće se pojavljuju mikrofluidni testovi i tzv. tehnologija Labon-chip (LOC) bazirana na nanočesticama i čipovima.
Testovi se izvode iz minimalnih količina uzoraka koji se nanose na plastične ili kartonske nosače, ubace se u male portabilne ručne aparate na baterije u kojima se odvija cijeli dijagnostički proces. Nakon procesuiranja vizualni signal se prosljeđue u detektor koji će definirati rezultat na digitalnom ekranu. Rezultat se može digitalno proslijediti do laboratorija za interpretaciju. Mikrofluidni testovi poznati se desetak godina i mogu postići jako nisku cijenu čime postaju zanimljivi za različite sredine, no nisu još komercijalizirani. Pretpostavlja se da će se primjena LOC tehnologije u medicini, kada se bude proizvodila na prilagodljiv i isplativ način, moći usporediti s utjecajem mikroprocesora na promjene u svakodnevnom životu.
ZAKLJUČAK
Dijagnostika HIV-infekcije značajno se promijenila od otkrića HIV-a i vremena kada se koristila samo za testiranje krvi i krvnih pripravaka. Razvijene su različite metode prilagođene različitim sredinama i ispitanicima. Period negativnog prozora je skraćen, pozitivna prediktivna vrijednost testova je bolja, rezultati su dostupni brzo. Odabrati najbolji test s obzirom na brojne mogućnosti nije jednostavno. Potrebno je poznavati prednosti i nedostatke metoda i odlučiti se za kombinaciju testova koji će biti optimalni za ispitivanu populaciju. Nisu svi testovi jednako dobri za različite sredine i ispitanike. Dijagnostika za HIVinfekcije razlikuje se od transfuzijskog ispitivanja krvi i krvnih pripravaka. Poznavanje performansi testa i nalaza važno je u interpretaciji rezultata. Interpretacija rezultata mora uvijek biti u skladu s kliničkim, anamnestičkim i epidemiološkim podacima ispitanika.
Autor: Doc.prim.dr.sc. Oktavija Đaković Rode, Klinika za infektivne bolesti „Dr. Fran Mihaljević“, Stomatološki fakultet Sveučilišta u Zagrebu
